Nanotecnologia I: 2012

Aplicação de diferentes métodos para a formulação de PEG-lipossomas
de oxaliplatina: Avaliação in vitro e in vivo

Resumo

Neste trabalho foram aplicados três métodos de preparação: método de hidratação do filme lipídico (FM), evaporação em fase reversa (REV) e o método de aquecimento (HM). Foram utilizados lipossomas de lipídios naturais neutros e catiônicos[f3] , respectivamente, com oxaliplatina[f2 e revestidos com PEG[f1] . As formulações desenvolvidas com os três métodos mostraram as mesmas características físico-químicas, com exceção da carga de oxaliplatina a qual foi estatisticamente inferior (P <0,05) para o método HM.

A incorporação de um lipídio semissintético na formulação desenvolvida por FM forneceu lipossomas com um tamanho de partícula de 115 nm associadas com o menor índice de polidispersão e a carga mais elevada de droga, 35%, em comparação com os outros dois lipídios, o que sugere um aumento na estabilidade da membrana. Essa estabilidade também foi avaliada de acordo com a presença de colesterol, o efeito da temperatura, bem como a aplicação de agentes crioprotetores diferentes durante o processo de liofilização. Os resultados indicaram estabilidade de longo prazo na formulação desenvolvida porque após a sua administração in vivo por via intravenosa em ratos portadores de tumor HT-29 [f4] foi capaz de induzir uma inibição do crescimento do tumor significativamente maior (P <0,05) do que a inibição causada pelo fármaco livre. Concluíndo, o método FM é o mais simples em comparação com HM e REV para desenvolver lipossomas in vivo revestidos com PEG de oxaliplatina estáveis e eficientes com uma carga mais elevada do que as encontradas no método REV.

Abbreviations: PC, Phosphatidylcholine; HSPC, soy hydrogenated L-α-phosphatidylcholine; DOTAP, 1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-propane; DSPE-PEG200, 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[maleimide(polyethylene glycol)-2000]; Chol, cholesterol; PDI, polydispersion index; EE, encapsulation efficacy; LP, liposome; REV, Reverse-Phase Evaporation; FM, Film Method; HM, Heating Method; RT, room temperature; TC, transition temperature; FBS, Fetal Bovine Serum; ED, encapsulated drug; pHi, internal pH; pHo, outside pH; 5-FU, 5- fluorouracil.

1. Introdução

Os lipossomas são transportadores eficientes de medicamentos, vacinas, nutrientes, diagnósticos e outras biomoléculas. Isto é devido a algumas vantagens, tais como a capacidade de incorporar água e agentes lipídicos solúveis, grande versatilidade em termos de fluidez da membrana lipossomal, o tamanho e a sua carga superficial. A nova geração de lipossomas através da inserção de polietilenoglicol (PEG - HO(C2H4O)nH) em derivados de fosfolipídios de membrana lipossomal conduz à obtenção de lipossomas estericamente[f5] estabilizados. As principais características desses lipossomas são a diminuição na eliminação e o aumento da sua acumulação nos sítios de órgãos afetados. Portanto, este sistema é capaz de alterar a farmacocinética e biodistribuição do fármaco encapsulado. A oxaliplatina é a terceira geração de drogas de platina (Pt) antitumoral usada como quimioterapia de primeira linha para o câncer colorretal metastático. Este derivado de Pt apresenta melhor tolerância nos efeitos adversos do que a cisplatina ou carboplatina. No entanto, a sua eficácia é relativamente baixa devido às suas propriedades farmacocinéticas, tais como a alta ligação plasmática irreversível em proteínas do tecido e dos eritrócitos, entre outros componentes. Por esta razão, o encapsulamento de oxaliplatina representa uma estratégia para ultrapassar estas limitações carreando de forma seletiva o medicamento para dentro do tumor.

Por outro lado, os métodos usados para preparar os lipossomas têm um impacto significativo em algumas características físico-químicas, tais como o tamanho ou a eficiência de encapsulação do agente. Desta forma, o método de hidratação do filme lipídico (FM) e o método de evaporação em fase reversa (REV) foram selecionados por vários autores como dois métodos convencionais para preparar os lipossomas. No entanto, nos últimos anos, outros métodos têm sido descritos na literatura e um deles é o método de aquecimento (HM). Este novo método é caracterizado pela ausência de um solvente orgânico para a solubilização de lipídios, o que representa uma vantagem em termos de toxicidade. Em geral, todos os métodos têm vantagens e desvantagens.

FM é caracterizado pelo fato de que ele pode ser usado para todos os tipos diferentes de combinações de lipídios e é muito fácil de realizar. O passo principal é a hidratação dos lipídios e as taxas de encapsulação aceitáveis que podem ser obtidas. Para REV o passo principal consiste na emulsão de óleo/água a qual é diluída com fase aquosa adicional para a formação de lipossomas. Este método é muito popular devido a uma alta taxa de encapsulação, até 50%; no entanto, o problema é o solvente restante e o elevado índice de polidispersão (PDI) no tamanho da partícula. Em ambos os casos, para a formação de uma população homogênea de lipossomas em relação ao tamanho de partícula é necessária a aplicação de uma técnica de homegeneização. Finalmente, o HM não tem sido amplamente aplicado, porque são apenas alguns exemplos relatados na literatura com o 5-FU [f6] e DNA.

Tendo em conta que a maioria das publicações sobre lipossomas de oxaliplatina usaram o método REV, o objetivo do presente trabalho foi o desenvolvimento de lipossomas revestidos com PEG de oxaliplatina usando diferentes métodos e lipídios. Também se avaliou a estabilidade da formulação sob diferentes condições. Além disso, a citotoxicidade e os efeitos antitumorais, respectivamente, foram testados in vitro e em modelos in vivo com células de câncer colorretal.

2. Materiais e métodos

2.1.Materiais

A Oxaliplatina foi adquirida de Sigma (Barcelona, Espanha). Fosfatidilcolina (PC), colesterol (Chol), soja hidrogenada La-fosfatidilcolina (HSPC), 1,2-dioleoil-3-trimetilamónio- propano (DOTAP) e 1,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina- N-[maleimida (polietileno glicol) -2000] (DSPE-PEG 2000) foram adquiridos da Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, Alabama, EUA).

2.2. Métodos

2.2.1. Preparação dos lipossomas com oxaliplatina

Três métodos diferentes foram realizados para desenvolver lipossomas carregados de oxaliplatina.

2.2.2. Método de hidratação do filme lipídico

Os lipossomas contendo oxaliplatina foram preparados empregando o método de hidratação do filme lipídico fino de acordo com as especificações de base descrito por Bangham e Lea. Resumidamente, os lipídios foram dissolvidos em clorofórmio formando uma mistura. O solvente orgânico foi então removido por evaporação rotativa sob pressão reduzida (Büchi-R144, Suíça) à temperatura ambiente (RT) para se obter um filme na parede do balão. O filme de lipídio seco foi hidratado com uma solução de oxaliplatina dissolvida em glicose a 5% (2 mg/ml). A dispersão do lipídio foi facilitada por agitação mecânica em banho de ultrassons durante 1 min. Para controlar o diâmetro das partículas a emulsão foi extrudida através de uma membrana de policarbonato (Mini-Struder Set, Avanti Polar Lipids Inc (Albaster, Alabama, EUA)) com um tamanho de poro de 100 nm.

2.2.3. Método de evaporação em fase reversa

Este método, descrito por Szoka e Papahadjopoulos, é usado para preparar os lipossomas com um espaço interno aquoso grande. Os lipídios, solubilizados numa mistura de clorofórmio: éter dietílico (1:2, v/v), foram adicionados à fase aquosa contendo oxaliplatina (4 mg/mL) dissolvida em glicose a 5%, numa proporção de 3:1 (v/v) entre a fase orgânica e a fase aquosa. A mistura foi ultrasonicada à temperatura ambiente durante 5 minutos e colocou-se no evaporador rotativo para remover o solvente orgânico sob pressão reduzida (200 mm Hg). Neste ponto o material formou um gel viscoso o qual foi agitado num vórtex tornando-se uma suspensão aquosa. Os lipossomas foram extrudidos seguindo o método descrito anteriormente.

2.2.4. Método de aquecimento modificado

Na técnica anterior, o método de aquecimento foi combinado com um gradiente de pH. Os lipídios foram hidratados em solução de citrato (pH 4) e misturados num banho de ultrassom durante 1 min. A mistura foi submetida à extrusão tal como foi descrito nos métodos anteriores e o excesso de citrato foi removido por ultrafiltração (Amicon com uma membrana de corte de 10.000 MWCO membrane, Millipore, Billerica, EUA). A incorporação de oxaliplatina (2 mg/mL) dissolvida em glicose a 5% foi conseguida por adição da solução juntamente com solução Hepes[f7] [f8] (pH 7,8). Esta mistura foi aquecida à temperatura de transição de lipídios (60 °C) durante 30 min. Depois, arrefeceu-se a 4 ºC.

Em todos os métodos a quantidade de oxaliplatina não encapsulada foi removida da formulação por ultrafiltração utilizando o dispositivo Amicon (10.000 MWCO). A formulação final foi lavada, no mínimo duas vezes, com 3 ml de PBS [f9] e ultrafiltrada novamente. Para avaliar a eficácia do presente método uma concentração constante de oxaliplatina livre (1 mg/mL) foi adicionada aos lipossomas vazios. Esta mistura foi agitada durante 30 min à temperatura ambiente e foi ultrafiltrada usando o sistema Amicon (10.000 MWCO) a 2200 g durante 30 min. Após a ultrafiltração foram coletadas amostras dos lipossomas e da solução ultrafiltrada para medir os níveis de oxaliplatina pela técnica de espectrometria de absorção atômica. Os lipossomas sem oxaliplatina, formulação vazia, foram preparados seguindo o mesmo procedimento, mas com adição de glicose a 5%.

Estes métodos foram realizados com dois tipos diferentes de lipídios, neutros PC (fosfatidilcolina) e catiônicos DOTAP[f10] - 1,2-dioleoiloxi-3-[trimetryammonio] propano) a fim de estudar a influência deles nas características físico-químicas dos lipossomas e na eficiência de encapsulação (EE) de oxaliplatina.

2.3. Caracterização dos lipossomas

O tamanho das partículas, o índice de polidispersidade (PDI) e o potencial zeta dos lipossomas foram analisados por difração de raio laser com um Zetasizer Nano-Z (Malvern Instruments, UK). As formulações foram diluídas a 1:100 (v/v) em água deionizada a fim de assegurar uma intensidade convenientemente dispersa no detetor.

O encapsulamento da oxaliplatina foi medido por espectrometria de absorção atômica usando o método padrão. Em seguida, a EE, expressa em porcentagem (%), foi calculada dividindo a taxa de fármaco por lipídio recuperado, após a ultrafiltração na formulação final com a quantidade inicial de oxaliplatina e lipídios. A concentração de fosfolípidos foi quantificada seguindo o método de Zöllner e Kirsch.

2.4. Estabilidade de formulações de lipossomas

A estabilidade é um fator crítico que deve ser considerado durante o projeto de formulação e desenvolvimento. A estabilidade física ou coloidal, com base na distribuição de tamanho sob condições de armazenagem bem como num meio biológico deve ser considerado. Com base nos resultados obtidos durante a formulação dos lipossomas, os lipossomas HSPC desenvolvidos com FM foram selecionados para caracterizar a estabilidade dos lipossomas formulados sem e com o colesterol [HSPC:Chol:DSPE-PEG₂₀₀₀]. Chol foi utilizado a 40% na mistura lipídica.

Além disso, outras abordagens diferentes foram seguidas para concluir este estudo:

2.5. A liberação de drogas

Este estudo foi conduzido a duas temperaturas diferentes, 4 °C utilizada para o armazenamento da formulação e 37 ºC utilizada para estudos in vitro e in vivo. Em seguida, foi misturado 100 µl da formulação com 900 µl de célula média completa e foi incubada a 37 ºC em agitação contínua. As amostras foram recolhidas em momentos diferentes: 0, 1, 4, 7, e 24 h e foram ultrafiltradas usando o sistema Amicon (10.000 MWCO) para obter os lipossomas. Os níveis de oxaliplatina encapsulada e liberada foram quantificados por espectrometria de absorção atômica. Além disso, os parâmetros do tamanho de partícula, PDI, e do potencial Zeta, foram também caracterizados por esses exemplos.

2.6. Ensaio de liofilização

As formulações foram liofilizadas depois de três estratégias diferentes: sem crioprotetor, com trealose (4:1, w/w açúcar:lipídio) ou com L-arginina (4:1, w/w aminoácidos:lipídio). Após o processo de liofilização a formulação foi de novo caracterizada por determinar o tamanho, PDI e potencial Zeta.

2.7. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)

Os lipossomas formulados com e sem DSPE-PEG₂₀₀₀ foram analisados por TEM. As medidas foram realizadas por meio de um microscópio de elétrons LIBRA-Zeiss 120 operando a 80 kV, equipado com um espectrômetro de elétrons filtrando elétrons inelásticos para uma melhor imagem. Dez microlitros da amostra foi incubada com OsO₄ a 1% durante 30 min. Vinte microlitros da mistura foi depositada sobre grades de carbono revestidas com cobre, de malha 200, durante um período de 60 s para secagem. A coloração de contraste negativo foi realizada usando 2% de solução aquosa de ácido fosfotúngstico. As amostras foram visualizadas 24 h mais tarde. O mesmo protocolo foi seguido para o controle negativo correspondente a uma amostra sem lipossomas. As imagens foram analisadas usando o software iTEM Olympus Soft Imaging Solutions GmbH 5,1.

2.8. Atividade anti-proliferativa em células cultivadas

As linhagens de células de câncer colorretal HCT-116 e HT-29 (adquiridas a partir de ATCC) foram cultivadas usando a média de McCoy modificada completada com soro fetal bovino (10%) e penicilina-estreptomicina (0,01%) a 37 ºC numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO₂. Todas as células foram utilizadas no âmbito de condição de sub-confluência. As células, com uma densidade de 10 x 10³ cells/well/200 µl (200 µl de células por poço) em média, foram semeadas em microplacas para titulação com 96 poços. Após 24 h as células foram tratadas com várias concentrações (limitadas de 0,1 a 50 µM) de oxaliplatina livre, lipossomas vazios ou lipossomas de oxaliplatina para 72 h. As células sobreviventes após cada tratamento foram medidas com o ensaio colorimétrico de vermelho neutro (Neutral Red Assay). A densidade óptica foi lida a 540 nm (Labsystems iEMS Reader MF).

2.8.1. No estudo in vivo

Vinte e quatro ratos nus atímicos fêmeas pesando 20-25 g (aprox. 4 semanas de idade) foram adquiridos da Harlan (Barcelona, Espanha). Os animais foram alojados em gaiolas microisoladas sob ventilação com pressão positiva e mantidos fechados em prateleiras para evitar o contato com agentes patogênicos, odores ou ruídos em condições padrão de laboratório. Comida esterilizada e água estavam disponíveis ad libitum.

Para induzir o tumor foram injetados subcutaneamente no flanco direito dos ratos 100 µl de PBS contendo 1,5 x 10⁶ de células HT-29. O crescimento do tumor expressado como volume (V) foi calculado por V = 4/3p (A²B/2), em que A e B correspondem ao diâmetro menor e maior, respectivamente. Uma semana após a injeção de células e quando o volume do tumor chegou a cerca de 200 mm³, os animais foram aleatoriamente divididos em quatro grupos com seis animais por grupo: Grupo I, controle (PBS), Grupo II, os animais tratados com lipossomas vazios na dose correspondente de oxaliplatina, Grupo III, oxaliplatina livre (5 mg/kg) e Grupo IV, oxaliplatina encapsulada em lipossomas (5 mg/kg). A dose de lipossomas foi calculada com base na µg (microgramagem) de oxaliplatina encapsulada por mg de lipídio, evitando uma concentração superior a 1,25 mg de lipídios em cada injeção. Todos os animais receberam dois ciclos consecutivos de tratamento com 5 dias de intervalo. Em cada um deles, duas doses de 2,5 mg/kg a cada 48 h foram administradas. No final do estudo os animais foram sacrificados por deslocamento cervical. O tumor foi removido para quantificar os níveis de oxaliplatina. Este órgão foi pesado e homogeneizado com ácido nítrico 0,1 N durante a noite (100 mg de tecido/1 mL de ácido) e diluído com 5 mL de água deionizada. Em seguida, as amostras foram medidas por espectrometria de absorção atômica. A toxicidade foi também avaliada através da medição do peso corporal ao mesmo tempo em que o tumor. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Experimentação Animal da Universidade de Navarra e está em conformidade com as orientações europeias.

2.9. A análise estatística

Os resultados foram expressos com o desvio padrão da média ± (SD). O estudo estatístico foi realizado utilizando o programa SPSS, versão 15.0 para Windows. Todos os dados foram analisados com o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis seguido do teste U de Mann-Whitney. O nível de significância foi estabelecido em P <0,05.

3. Resultados

3.1. Caracterização dos lipossomas revestidos com PEG de oxaliplatina

3.1.1. Método de hidratação do filme lipídico

Os resultados encontrados com FM são mostrados na Tabela 1. O tamanho da partícula era semelhante para ambas as formulações uma vez que era esperado devido à utilização da técnica de extrusão com o mesmo tipo de membrana. O potencial Zeta foi negativo para PC, devido à combinação de PEG, e positivo para DOTAP, um típico lipídio catiônico. Em relação à EE, as porcentagens foram semelhantes entre os dois lipídios, embora fosse ligeiramente mais elevada para o PC do que para o lipídio catiónico (P> 0,05). No entanto este valor foi maior do que os relatados por outros autores.

3.1.2. Método de evaporação em fase reversa

REV é a técnica mais comum usada para encapsular derivados de platina. A Tabela 1 mostra os resultados encontrados para os lipossomas de oxaliplatina em que todos os parâmetros foram muito semelhantes para os dois lipídios, exceto o potencial Zeta, tal como era esperado. A EE de drogas foi um pouco menor para DOTAP, mas essa diferença não foi significativa (P> 0,05), sugerindo que o método determinou do mesmo modo com a independência da carga iônica do lipídio.

3.1.3. Método de aquecimento modificado

Este método foi modificado adicionando tampões de citrato e Hepes para alcançar um gradiente de pH. Esta alteração foi porque a quantidade de oxaliplatina incorporada nos lipossomas sem diferença de pH entre interior/exterior era muito baixa, cerca de 6%. No entanto, quando a oxaliplatina foi numa solução de pH 7,8, a taxa de encapsulação foi superior a 20%. Embora o tamanho e o potencial Zeta obtidos nestas formulações foram semelhantes aos observados com os outros dois métodos e a EE deu menor (P <0,05) (Tabela 1).

Não foram observadas diferenças entre os lipossomas com vs. sem oxaliplatina em cada um dos métodos (dados não mostrados).

Os três métodos podem ser considerados para a fabricação de lipossomas de oxaliplatina. No entanto, o REV foi um dos mais complexos devido ao número de passos. Na verdade, várias condições iniciais de proporção oxaliplatina/lipídio foram testadas para aumentar a carga, mas este valor não aumenta quando a quantidade de oxaliplatina for maior do que 4 mg/mL. Além disso, a suspensão de lipossomas mostrou elevada polidispersidade em termos de tamanho. A razão pode ser que para obtenção de população homogênea de lipossomas, a técnica de extrusão pode ser aplicada com dois tipos de membranas, antes do passo de evaporação.

Por outro lado, embora o método HM tem a vantagem de produzir lipossomas sem solventes orgânicos voláteis para dissolver os lipídios, o EE de oxaliplatina foi o mais baixo em comparação com FM ou REV. O passo principal é a incorporação do fármaco para os lipossomas previamente formulados por aquecimento a uma temperatura não inferior à temperatura de transição (T_c) dos lipídios. Esta T_c foi cerca de 60 ºC, que não é suficientemente elevada para modificar a estabilidade da molécula de platina.

Com base nos resultados obtidos na Tabela 1, o FM pareceu ser o método mais simples para preparar lipossomas que tenham tamanho adequado, PDI e EE de oxaliplatina. Como o PC e DOTAP foram usados como dois lipídios de base para a seleção do método, outro lípido semi-sintético hidrogenado, HSPC, foi incluído. Este lipídio era de interesse porque é um dos principais componentes de várias formulações lipossomais comercializadas. Lipídios com diferentes graus de saturação na sua cadeia alifática parecem proporcionar um maior efeito de estabilização da membrana lipossomal. Os parâmetros físico-químicos da presente formulação foram semelhantes aos obtidos para os lipossomas formulados com PC. Assim, o tamanho da partícula para esta formulação foi de 115,6 ± 2,0 nm, com um potencial zeta de -18,4 ± 3,9 mV, a EE foi 34,23 ± 2,9% e uma carga de 68,5 ± 4,2 µg/mg de lipídios. Além disso, o PDI foi menor do que a formulação de PC, 0,034 ± 0,01 vs. 0,161 ± 0,02, sugerindo que o HSPC contribuiu para aumentar a estabilização da membrana. Portanto, o lipossoma HSPC-DSPE-PEG₂₀₀₀ foi selecionado para os próximos estudos.

3.2. Ensaio de estabilidade

Estudos anteriores mostraram que a 4 °C as formulações eram estáveis no que diz respeito ao tamanho do potencial Zeta e da EE, pelo menos, durante 1 mês. O impacto de vários fatores, tais como a inclusão de Chol (colesterol), a temperatura, diferentes soluções para a incubação e processos de liofilização, foram também investigados para avaliar a retenção de oxaliplatina nos lipossomas. A Tabela 2 mostra que a 37 ºC a inclusão do esterol aumentou a estabilidade da membrana, embora a diferença na retenção de oxaliplatina entre ambas as formulações, com vs. sem Chol, foi de apenas 10%. No entanto, a libertação da droga no meio de cultura celular foi mais lenta para lipossomas com Chol, sugerindo que esta versão leva tempo porque o Chol é capaz de estabilizar as bicamadas lipídicas. Por conseguinte, um efeito de depósito na área de tumor pode ser conseguido utilizando esta formulação lipossômica peguilada (com PEG). Este efeito constitui uma vantagem para a oxaliplatina, porque a droga seria mais estável na circulação sanguínea e pode ser liberada lentamente no local do tumor. Além disso, o PDI tinha um valor mais elevado para lipossomas sem Chol. Esta observação está de acordo com a agregação das partículas.

Uma vez que a integridade estrutural dos lipossomas para um longo período de tempo é um dos objetivos para otimizar a formulação, o efeito do processo de desidratação/reconstituição foi ensaiado neste trabalho. Dois diferentes crioprotetores, trealose e L-arginina, foram usados para prevenir a instabilidade termodinâmica avaliada por mudanças no tamanho e no potencial Zeta. L-arginina foi incluído pensando nos possíveis problemas de pacientes diabéticos. Os resultados listados na Tabela 3 mostram que a presença na formulação com Chol juntamente com trealose ou L-arginina é a melhor combinação para se obter uma formulação estável. Ambos os crioprotetores mostraram um comportamento semelhante suportando o fato de que os mesmos podem ser utilizados.

3.3. Microscopia eletrônica de transmissão (TEM)

A fig. 1 mostra que lipossomaa de HSPC:Chol são pequenas vesículas com um espaço interior concêntrico. No caso dos lipossomas associados a DSPE-PEG₂₀₀₀ uma película branca revestida foi observada na superfície.

3.4. Estudos citotóxicos em células com câncer colorretal

As duas linhas de células eram sensíveis para a oxaliplatina com valores de IC₅₀ entre 9,2 e 2,8 µM para o fármaco livre. Os lipossomas carregados de oxaliplatina mostraram uma citotoxicidade reduzida. Este efeito foi observado para os três tipos de lipídios utilizados na formulação. A Tabela 4 lista os valores de CI₅₀ encontrados para os tratamentos em ambas as linhas celulares, HT-29 e HCT-116. O HCT-116 foi mais sensível à oxaliplatina livre e encapsulada do que o HT-29. O efeito citotóxico foi maior em ambas as linhas celulares para livre do que para a oxaliplatina encapsulada em lipossomas aniônicos, PC LP e HSPC LP. No entanto, no caso dos lipossomas catiônicos, o valor do IC₅₀ foi muito semelhante ao valor do fármaco livre. Esta diferença pode ser explicada pelo efeito dos lipossomas DOTAP vazios. Eles foram capazes de reduzir em 30% o efeito proliferativo em comparação com o grupo de controle. Os lipossomas PC e HSPC sem oxaliplatina não afetaram a proliferação celular.

3.4.1. No estudo in vivo

A formulação dos lipossomas [HSPC:Chol:DSPE-PEG₂₀₀₀]-oxaliplatina foi administrada por via intravenosa nos ratos portadores do tumor HT-29. A dose foi selecionada com base nos resultados anteriores encontrados no nosso grupo (dados não apresentados) e com base na dose relatada por Abu Lila et al., embora as linhas celulares não fossem as mesmas. A fig. 2 mostra que os lipossomas peguilados suprimiram o crescimento de tumores de forma mais eficiente do que a oxaliplatina livre. Esta inibição foi estatisticamente significativa (P <0,05) durante o segundo ciclo. Esta atividade antitumoral intensificada dos lipossomas está em linha com os resultados descritos por vários autores para drogas antitumorais diferentes encapsulados em lipossomas peguilados. Os níveis de oxaliplatina encontrados no tumor no final do estudo eram três vezes mais elevados para a droga encapsulada, em comparação com o fármaco livre: 560 ± 200 vs. 190 ± 101 ng/mg de tecido, respectivamente. Além disso, este esquema de dose é compatível com a baixa toxicidade dos dois tratamentos (Fig. 3). Assim, a encapsulação da oxaliplatina exibiu uma melhoria no efeito terapêutico da droga.

4. Discussão

Neste trabalho, os lipossomas peguilados de oxaliplatina foram desenvolvidos utilizando diferentes métodos. FM e REV foram selecionados como os métodos mais comuns utilizados para preparar os lipossomas convencionais. O HM foi escolhido como um dos métodos novos introduzidos nos últimos anos. A ausência de solventes orgânicos voláteis neste último método é a principal característica. Ela representa um benefício potencial em relação à toxicidade exercida por estes componentes in vivo. Além disso, dois tipos de lipídios são utilizados para avaliar a sua influência nas características físico-químicas das formulações obtidas para cada tipo de método. Os resultados mostraram que o lipídio não tem qualquer influência nas características estudadas. No entanto, no caso do método de REV o tamanho de partícula foi ligeiramente mais elevada do que no FM e HM mesmo quando todos os métodos foram associados com a técnica de extrusão com o mesmo tipo de membrana de policarbonato. Esta diferença pode ser explicada pelo fato de que o REV é um dos métodos mais complexos em comparação com FM e HM. Por exemplo, o passo principal é a formação de um gel viscoso o qual é responsável pela formação espontânea de dispersão dos lipossomas. As características destes lipossomas dependem da mistura (lipídio-água) na emulsão e do tempo de evaporação, entre outros passos. Isto leva a uma maior variabilidade nas formulações finais do que com os outros dois métodos que são metodologicamente mais simples.

No caso do HM, o encapsulamento de oxaliplatina dissolvida em glicose a 5%, era extremamente baixa (aprox. 6%). No entanto, quando um gradiente de pH da formulação lipossomal foi alcançado entre o interior (pHi 4) e exterior (Pho 7.8), a eficiência de encapsulação alcançou níveis de 20%. Este resultado é da mesma ordem de valores relatados por outros autores para oxaliplatina utilizando o método de REV. Em geral, o transporte entre bicamadas de ácidos fracos e bases fracas são mais eficientes na presença de um gradiente de pH, mas pouco ou nenhum encapsulamento é observado na ausência deste gradiente, como foi demonstrado para a doxorrubicina.

Finalmente, o FM associado com a técnica de extrusão permitiu a formulação de uma população homogênea de lipossomas seguindo passos muito simples. Apesar de algumas formulações lipossomicas com outras drogas anti-tumor terem sido desenvolvidas utilizando este método, a oxaliplatina têm sido formulada com REV. A principal vantagem do método (FM) é a taxa de encapsulação que pode ser de até 50%. No entanto, uma diferença significativa é encontrada em relação ao tamanho de partícula e de EE de oxaliplatina dependendo do autor. Por exemplo, com REV e lipídios neutros, Abu Lila et al relataram lipossomas com um tamanho de partícula de 200 nm e uma EE de 20% superior à encontrada por Suzuki et al. No ano passado, Yang et al descreveram a metodologia para o desenvolvimento de PEG-lipossomas de oxaliplatina com um tamanho de partícula de 150 nm e uma EE de 40%. Note-se que este valor não tem sido descrito como ele foi calculado.

Neste trabalho, o tamanho de partícula foi reduzido para 115,3 ± 3,5 nm obtendo uma EE de 34,2 ± 2,9%. O carreamento do fármaco foi calculado como Abu Lila e colaboradores descreveram. Embora várias concentrações de oxaliplatina (2, 4, e 5 mg/mL) foram analisadas, a carga não se alterou entre 4 e 5 mg/mL.

Por outro lado, técnicas diferentes foram encontradas na literatura para a remoção do fármaco não encapsulado: a técnica de diálise contra 5% de dextrose ou a ultrafiltração. No nosso estudo, a técnica de ultrafiltração aplicada mostrou que a 99,72% do fármaco livre adicionado aos lipossomas vazios na solução foi ultrafiltrado justificando a sua utilização.

Os três métodos têm um comportamento semelhante para os lipídios neutros e catiônicos, como foi anteriormente relatado por Abu Lila et al. Estes dados demonstram que cada método para encapsular uma droga específica tem um comportamento semelhante com uma não-dependência da carga superficial do lipídio.

Tendo em conta que as formulações obtidas com os três métodos foram muito semelhantes, o FM foi selecionado para o estudo de vários fatores que influenciam a estabilidade das formulações. Um deles é o uso de lipídios semissintéticos como o HSPC (hydrogenated soybean phosphatidylcholine – fosfatidilcolina de soja hodrogenada), um componente de muitas formulações lipossomais comercializadas, tais como Doxil ou Caelyx para a doxorubicina (HSPC/Chol/DSPE-PEG₂₀₀₀); Ara-c (HSPC/Chol/DSPE-PEG₂₀₀₀); Lurtotecan (HSPC/Chol); Ambisome (HSPC/Chol/DSPG). Embora as características físico-químicas dos lipossomas HSPC fossem semelhantes às encontrados no PC, o PDI foi menor e a EE ligeiramente superior. O grau de saturação da cadeia alifática do lipídio confere uma estrutura mais dinâmica para a membrana. Esta propriedade deve representar uma vantagem para aprisionar mais drogas com uma baixa permeabilidade através das membranas celulares, como no caso com a oxaliplatina.

Finalmente, o HSPC LP foi selecionado para estudar outros fatores que influenciam a estabilidade da formulação. Estes fatores foram a temperatura a 37 ºC, o meio da incubação de lipossomas e a presença de Chol na membrana. No caso da incorporação do Chol, este fator não influenciou significativamente a quantidade de oxaliplatina liberada. Após 24 h de incubação a 37 ºC, ambos os tipos de formulações, com e sem esterol, liberaram oxaliplatina com uma diferença de 10%. Esta diferença na concentração do fármaco sugere um impacto mínimo no efeito. No entanto, o aspecto mais importante da atividade in vivo é o timerelease (tempo de liberação) da droga. Portanto, este ponto pode ser uma limitação para a formulação de novos estudos. Neste trabalho, o tempo de retenção de oxaliplatina na formulação testada em meio de cultura celular foi ligeiramente maior do que o valor encontrado por Abu Lila et al no plasma. O plasma não têm as mesmas composições de meio da cultura celular, mas a sua complexidade sugere que o comportamento da formulação pode ser semelhante à do plasma.

Em seguida, o Chol exerceu a sua função como um agente de estabilização da membrana lipossomal que se refletiu no PDI mais baixo comparado com o PDI de formulações sem Chol. Portanto, a formulação final utilizando a mistura de HSPC:Chol:DSPE-PEG₂₀₀₀ foi selecionada para a análise da atividade in vivo.

Os resultados encontrados com a técnica de liofilização representam uma estratégia promissora para proporcionar uma formulação estável durante um longo período de tempo. Açúcares têm sido relatados para atuar como agentes protetores durante a desidratação/reconstituição dos lipossomas por meio da prevenção da fusão das vesículas, melhorando a retenção dos compostos encapsulados dentro dos lipossomas. Isto porque os aminoácidos apresentam efeito lypoprotective (lipoprotetor) semelhante aos açúcares, a L-arginina foi analisada em relação aos problemas de pacientes com diabetes. A aplicação de aminoácidos ou açúcares como crioprotetores potenciais não mostraram diferenças significativas, embora em ambos os casos a presença de Chol leva a uma estabilidade notável dos lipossomas durante o processo de liofilização. Este efeito foi relatado anteriormente por Popova e Hincha. Eles relataram uma interação entre os fosfolípidos e os açúcares devido à presença de Chol (colesterol). Este esterol poderia aumentar o espaço lipídico levando os açúcares a interagir com headgroups lipídicos (lipídios agregados de cabeça). No entanto, são necessários mais estudos para otimizar a utilização de agentes crioprotetores na liofilização de lipossomas, pois a EE dos lipossomas reconstituídas diminuiu em 6,1 ± 2,9%.

A atividade antitumoral in vitro mostrou que o HCT-116 teve uma maior sensibilidade para a oxaliplatina em comparação com o HT-29. Este resultado foi relatado por Kalimutho et al, que afirmam que o estado de p-53, do tipo selvagem em HCT-116 e mutado em HT-29, pode ser associado a este fenômeno para explicar esta diferença. Neste estudo, a oxaliplatina livre conduziu a um efeito melhor do que o antiproliferativo encapsulado (Tabela 4). Estes resultados estão de acordo com os resultados apresentados por diversos autores em relação a IC₅₀ (concentração necessária para inibir 50% da atividade da neuraminidase) para a droga livre vs. formulação lipossomal. No caso da formulação catiônica o seu efeito pode ser explicado pela citotoxicidade adicional encontrada nos lipossomas vazios descartando esses lipossomas de estudos posteriores. Além disso, a toxicidade in vivo de lipossomas DOTAP encontra-se relatada na literatura.

Por outro lado, o estudo in vivo realizado com lipossomas HSPC:Chol:DSPE-PEG₂₀₀₀ mostrou uma atividade anti-tumoral eficaz no modelo de xenoenxerto [f11] de tumor em murídeos (ratos), reflexo da estabilidade e da capacidade da formulação para atingir a área do tumor. Este resultado sugere que os lipossomas revestidos com PEG poderiam atuar como um depósito de oxaliplatina na área do tumor retardando a sua absorção de RES, devido à presença do PEG na superfície dos lipossomas. A atividade antitumoral para esta formulação foi mais evidente in vivo do que in vitro, o que está de acordo com os resultados encontrados por outros autores. Assim, os lipossomas revestidos com PEG de oxaliplatina desenvolvidos por FM, o método mais simples, fornecem uma potente atividade antitumoral em comparação com o fármaco livre.

No nosso conhecimento, este é o primeiro estudo em que os lipossomas revestidos com PEG de oxaliplatina foram desenvolvidos utilizando vários métodos, FM, REV, e HM para comparar o impacto deles nos parâmetros físico-químicos das formulações, incluindo a eficiência da encapsulação (EE). Além disso, o efeito da inclusão de um lipídio semissintético e do Chol, levou à obtenção de uma formulação estável durante o período de incubação a uma temperatura elevada e durante o processo de liofilização.

Finalmente, a eficácia antitumoral in vivo foi caracterizada por uma redução seguida por uma estabilização do tumor. Este efeito, em conjunto com os níveis de oxaliplatina encontrados neste órgão, sugerem uma estabilidade em longo prazo da formulação.

Agradecimentos
Este trabalho foi financiado por uma subvenção (PS09/02512-FISS ref.) do Governo espanhol e da Universidade de Navarra. Sara Zalba foi financiada por uma concessão do Governo de Navarra.

[f1]Polietilenoglicóis. Lipossomas de longa circulação.

[f2]A oxaliplatina é um análogo da platina diaminocicloexano de terceira geração. Seu mecanismo de ação é idêntico ao da cisplatina e carboplatina (geração de um complexo diamina-platina que reage com água e interage com o DNA, formando ligações inter e intracadeias e causando a desnaturação local da cadeia de DNA). No entanto, não apresenta resistência cruzada para células cancerosas que são resistentes à cisplatina ou carboplatina.

É indicada para Tratamento de câncer colorretal metastático.

[f3]Lipossomas catiônicos – Como o nome sugere, estes lipossomas apresentam carga positiva na superfície. Há duas décadas, com a escoberta de lipídeos catiônicos, estes lipossomas têm sido utilizados para iberação de ácidos nucléicos dentro das células (Dass, Choong, 2006). Os lipídeos catiônicos são moléculas anfifílicas compostas de uma ou duas cadeias de ácido graxo acopladas a um grupo éster e um grupamento aminíco hidrofílico (El-Aneed, 2004).

[f4]Câncer colorretal.

[f5]Relativo à geometria de uma molécula.

[f6]O 5-fluorouracil (5-FU) é um antineoplásico análogo pirimídico empregado no tratamento de muitos tipos de cânceres. Três diferentes mecanismos de citotoxicidade são atribuídos a este agente: incorporação de fluoronucleotídeos no DNA ou RNA e a inibição da enzima timidilato sintase. O 5-FU pode ser convertido ao seu metabólito ativo, o 5-fluoro-2´-deoxiuridina-5´-monofosfato (FdUMP), que por sua vez, pode inibir a enzima timidilato sintase (TS), responsável pela síntese de timidina monofosfato a partir de uridina monofosfato; a inibição de TS leva ao desbalanço do pool de nucleotídeos, diminuindo a concentração de dTTP, aumentando a de dUTP e, como conseqüência, levando à incorporação de uracil na cadeia de DNA.

[f7]Soluções tampão (química) são soluções que atenuam a variação dos valores de pH (ácido ou básico), mantendo-o aproximadamente constante, mesmo com adição de pequenas quantidades de ácidos ou bases.

[f8]HEPES é um tampão, ou seja, ele não permite grandes variações de pH e sua faixa de tamponamento é de 7,5 a 8,5 mais ou menos. Ou seja, se a solução estiver nesta faixa, você pode pingar ácido ou base (quase) à vontade que o pH se mantém estável.

[f9]Tampão fosfato-salino ou Phosphate Buffered Saline (abreviado PBS) é uma solução tampão comumente utilizada em bioquímica. É uma solução salina, contendo cloreto de sódio, fosfato de sódio e, em algumas formulações, cloreto de potássio e fosfato de potássio.

[f10]DOTAP é um reagente de transfecção monocatiônico baseado em tecnologia de lipossomas. DOTAP faz a transfecção de ácidos nucleicos com ou sem a presença de soro.

Transfecção é também o processo de entrega e expressão de material genético com sucesso.

[f11]Transplante de tecido. Enxerto de tecido.

Nanotecnologia I

quinta-feira, 20 de dezembro de 2012

Artigo Grupo 3

artigo, versão final. Anderson, Márcia e Octávio

Artigo do grupo 2

Artigo Grupo 4

quarta-feira, 12 de dezembro de 2012

Notas

terça-feira, 11 de dezembro de 2012

Repostagem do Artigo e apresentação do grupo 2

segunda-feira, 10 de dezembro de 2012

Apresentação Grupo I

domingo, 9 de dezembro de 2012

Grupo 4 - Artigo e apresentação

GRUPO 3 - APRESENTAÇÃO E O ARTIGO

apresentação do artigo

sábado, 1 de dezembro de 2012

CONVITE

terça-feira, 20 de novembro de 2012

Artigo Grupo 2 - Versão Prévia

segunda-feira, 19 de novembro de 2012

Artigo do grupo 3

domingo, 18 de novembro de 2012

Seminário III - Grupo 4

Artigo Seminário III

Colaboradores